Glutationi tai GSH , onkuin keskeisiä tripeptidin valmistettu kysteiini, glutamaatti ja glysiini . Se on voimakas antioksidantti, joka suojaasolujen ja elinten kehon haitallisilta vaikutuksilta ROS , tai reaktiivisia happiradikaaleja , jotka on muodostettu molekulaarisen hapen seurauksena eri aineenvaihduntaan elimistössä . Antioksidantit , kuten glutationi , neutraloidaanROS ja estää heitä vuorovaikutuksessa ja vahingoittaaDNA: ta ja proteiinia soluissa . Suhde hapettuneen ja pelkistetyn muodossa GSH elimistössä on osoitusROS – aiheuttamaa oksidatiivista stressiä body.Things tarvitset
Ruisku
perhosneulan
Sentrifugoidaan
Natriumhepariini
Pakastin
sulfosalisyylihappoa
GSH Reaktioaine
Microplate
Valonlähde
GSH standardiliuosta
Näytä enemmän Ohjeet
1
Draw noin 2 ml verta laskimopistoksella jaanticubetal laskimon23 gaugen butterfly neulaa 5 ml: n ruiskuun . Lisäänäyte koeputkiin , jotka sisältävät natrium- hepariinia ja varovasti kääntää putken sekoittamiseen .
2
Kerääpunasoluissa sentrifugoimalla näytettä 2500 kierrosta minuutissa viiden minuutin ajan . Jäätyä ja sulaanäyte kolme kertaa rikkoasoluja . Sentrifugoidaan solulysaatti liuoksessa 10 minuutin ajan 12000 rpm ja 4 astetta, ja supernatantti otetaan talteen .
3
Poista proteiinia näytteestä lisäämällä 5 prosenttia sulfosalisyylihapolla ja sentrifugoimalla näytettä 12000 rpm viisi minuuttia 4 ° C asteessa. Säilytä deproteinoidut Supernatantti -112 astetta .
4
Sekoitatioli tunnistus agentti , GSH -reduktaasi , nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti ja määrityspuskurissa osuuksina merkitty kitin valmistaja tehdäGSH reaktioseokseen. Kunkin kemiallisten riippuutestien määrää aiot suorittaa . Laimenna GSH reaktioseos 5 prosenttia sulfosalisyylihapolla saada pitoisuuksia 16 , 32 , 63 , 125 , 250 ja 500 mikrolitraa .
5
Lisää 1-10 mikrolitraadeproteinoidut verinäytteen kaivoihin mikrolevyn . Lisää sarjalaimennettua GSH vakio ratkaisu, joka on saatavilla testaus kit, kuhunkin kuoppaan , jottakokonaistilavuus kussakin kuopassa 10 mikrolitraa .
6
Lisää 90 mikrolitraa GSH Reaktioseoksen että teit vaiheessa 4 kuhunkin kuoppaanmikrolevylle . Sekoitareagenssi ravistamallalevyä 30 sekuntia .
7
Mitataan välittömästi asettamallalevyä valoa aallonpituuksilla 405 ja 415 nanometriä . Inkuboi levyä 30 minuuttia . Ottaa absorbanssilukemia välein viiden minuutin aikanainkuboinnin .
8
Laimennetaan 6 millimoolinjalostettujen näytteen 5 prosenttia sulfosalisyylihappoa ja trifluromethane naatti ratkaisu . Tämä poistaa kaikkivähensi GSH liuoksesta. Lisää 1-10 micoliters tätä liuosta kuoppiin mikrolevyllä ja toista vaiheet 5, 6 ja 7 . Tämä auttaa määrän arvioimiseksi hapettuneen GSH näytteessä .
9
Piirretäänabsorbanssi ja näytteen pitoisuudet kuvaajan saadaGSH käyrä sekä vähentää ja hapettuneen glutationin . Laskesuhde molemmissa muodoissa GSH . Lisääntyvät oksidatiivista GSH tasoilla osoittavat oksidatiivista stressiä ja ROS .