In vitro-kokeet ovat ne toteutettiin ulkopuolellaelävä organismi koeputkessa tai samanlainen ympäristö . Tutkijat voivat tehdä RNA- kopiosta tai geenin in vitro läpi kutsutaan in vitro-transkriptio . Entsyymi , joka tekeeRNA-transkriptin , joka perustuu geenin , kutsutaanRNA-polymeraasia. Yksi tällainen molekyyli onSP6 -polymeraasia. Se vaatiivenyttää DNA kutsutaanSP6 promoottori toimiakseen kunnolla . Promoottorit
promoottori onDNA-alue sitooRNA-polymeraasin transkription aloittamiseksi . SP6- polymeraasi vaatii , että hyvin spesifinen sekvenssi on läsnäpromoottori sitovasti , joten kun SP6- polymeraasia käytetään in vitro-transkriptio , geenin täytyy sisältää SP6- promoottorin ja transkription tapahtumisen . SP6 polymeraasi on peräisintyyppinen virus nimeltäbakteriofaagi ; biotekniikan yritykset tuottavat tätä polymeraasi tarttuu salmonellabakteerit faagilla ja sen jälkeen eristämälläpolymeraasi .
Expression
perusilmentymisen tai aktiivisuus tarkoittaailmentymätasopuuttuessa muita molekyylejä, jotka lisäävät tai vähentävät transkription tasoa . Aktivaattorit tai repressorit , esimerkiksi , ovat proteiineja , jotka voivat sitoutuapromoottorin tai muiden geenin säätely-alueet ja joko auttaa rekrytoinnissa-RNA-polymeraasia tai estää sen sitoutumisen . Indusoijat ovat molekyylejä , jotka tehostavat tuotantoa geenituotteen nostamalla ekspressiotasoja .
SP6
Basal toimintaaSP6 promoottori vaihtelevatolosuhteet kokeilun . Tärkeintä tietenkin on , miten koeolosuhteissa voi vaikuttaa toimintaan ja miten SP6 vertaa muihin järjestelmiin . Yleensä SP6 -polymeraasi ja promoottoreita matalammat hyötysuhde kuinT7 -tai T3- in vitro-transkriptio järjestelmissä , vaikka ihanteellisissa olosuhteissa SP6 on karkeasti verrattavissa näihin kahteen muuhun . Kuten SP6 , sekä T7 -ja T3 käyttääRNA-polymeraasi bakteriofagista .
Toimitusehdot
Suolapitoisuus ja lämpötila ovat kaksi tärkeimmistä tekijöistä määritettäessä perusaktiivisuutta . SP6 on hyvin herkkä suolapitoisuutta , joten suurempia suolakonsentraatioissa voi toiminta vähenisi huomattavasti . Kaikki muu pysyessä ennallaan , ilme on huomattavasti suurempi 104 celsiusta kuin 99 celsiusta . Nukleotidin pitoisuus on toinen tärkeä näkökohta . Alhaiset pitoisuudet saattavat aiheuttaa transkriptio lopettaa ennenaikaisesti ja siten vähentää tehokkuutta . Lisääntyvänukleotidin keskittymä välttää tämän ongelman . Jos olet syntetisointi RNA-koettimia , kuitenkin lisäämällä liian paljon leimaamattoman nukleotidi vähenee määrä leimatun nukleotidin lopputuotteessa .