TOPO- kloonaus on prosessi, jossa kloonausta , jossa käytetään yleisesti , 3 ’tähteitä, jotka ovat termodynaamisesti epävakaita ja yhdistää neTaq DNA-polymeraasia . Lisäksi , prosessi käyttäätuoretta polymeraasiketjureaktion tuote ( PCR) , joka on säilytettävä 4 astetta . Tämä muoto kloonauksen optimoi aktiivisen topoisomeraasi I -molekyyli lisätään loppuunlineaarisen vektorin . Suorittamaan TOPO kloonauksen ,tietty protokolla olisi noudatettava . Valmistelu
Jotkut perus toimenpiteisiin voidaan ryhtyä nopeuttaakseenyleistä TOPO kloonaus ja auttaa varmistamaan sen menestyksen . Ensinnäkin putket eläviä soluja olisi jäille säilyttää niiden hyväksyttävyyden . SeuraavaksiSuper optimaalinen kulttuuri ( SOC ) keskikokoinen , bakteerien kasvua rikastunut ravinteita , pitäisi lämmetä huoneenlämpöiseksi . Selektiivinen levyt olisi sitten esilämmittää 37 astetta , joten ne ovat täysin valmiita , kun on aika käyttää niitä .
Yhdistäminen Ainekset
Ennenkloonausta prosessi , yhdistelmä 2 mikrolitraa polymeraasiketjureaktio ( PCR ) tuotteiden , 0,5 mikrolitraa suolaliuosta , ja 0,5 mikrolitraa kloonausvektori olisi yhdistettävä0,5 millilitran sentrifugiputkeen . Kun yhdistetään, nämä aineet täytyy asettaa huoneenlämpötilassa ja annettiin inkuboitua viisi vaille kymmenen minuuttia . Seuraavaksi yhdistetyt ainesosat lisätään ” Top – 10 kemiallisesti kompetentteja soluja ” on 50 – mikrolitran putkeen ja sijoitettiin jäille vielä kymmenen minuuttia . Tämän jälkeen ,solut on lämpöshokki 42 Celsius-astetta täsmälleen ja pantiin jäihin vielä minuutin ajan , ennen kuin 180 mikrolitraaSOC-alustaa lisätään . Tämä seos pitäisi sitten ravisteltiin vaakasuunnassa 200 rpm : ssa vielä tunnin ajan 37 celsiusasteessa .
Lopullinen vaiheet
< p >Seosta, jossa oli 50 mikrolitraa ja 100 ui kustakin reaktiosta olisi päällystetty ulos ” päälle LB + AMP + X – Gal levyt ja inkuboidaan ravistelematta yön yli 37 C ” Seuraavana päivänäkolme valkoista pesäkettä kustakin reaktiosta on poiminut ja laitettiin 4 ml: aan LB + AMP ja jätettiin inkuboi yön yli lämpötilassa, joka on 37 astetta samalla, kun sitä ravistettiin 200 rpm: ssä. Viimeinen vaihe onmini – plasmidien valmistamiseksi ja odottaa nähdä onko prosessi oli onnistunut .